如何正确地建立实验室细胞库？

平时，研究人员细胞的来源有三种，一种是直接从商业化公司（如ATCC、DSMZ、中科院细胞所）购买，另一种为自己从原代组织分离，还有一种是从其他实验室或科研人员处获取。

既然如此方便，我们为什么要自己建立细胞库呢？有何意义？

细胞库可以有效保持贮存细胞的生物学效用和功能，为科研实验提供检定合格、质量稳定、可持续获得的细胞。

1. 节省实验室空间、时间、经费2. 若实验失败，还有重来的机会3. 确保实验重复的一致性4. 确保未来实验的连贯性因此实验室有必要建立一个安全、规范、稳定、可追溯的细胞库，我们需要从源头保证整个研究实验的规范性。目前，世界上较权wei的细胞库机构或者研究院都采用三级细胞库管理模式，即：原始细胞库（PCB，Primary Cell Bank），主细胞库（MCB，Master Cell Bank），工作细胞库（WCB，Working Cell Bank）。

1. 原始细胞库（PCB，Primary Cell Bank）

原始细胞库（PCB，Primary Cell Bank），又名细胞种子（Cell Seed）或初级细胞库（Pre-master Cell Bank），由一个原始细胞群体发展成为传代稳定的细胞群体，或者经过克隆培养形成的均一细胞群体，经检定证明合格。将一定数量、成分均一的细胞悬液定量装于细胞冻存管，与液氮或-130℃以下冻存，即为原始细胞库，供建立主细胞库使用。

2. 主细胞库（MCB，Master Cell Bank）

主细胞库（MCB，Master Cell Bank）指的是，原始细胞库细胞传代增殖后均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮或-130℃以下。这些细胞经检定合格后，即为主细胞库，供建立工作细胞库使用。

3. 工作细胞库（WCB，Working Cell Bank）

工作细胞库（WCB，Working Cell Bank）是经过主细胞库传代增殖，达到一定代次水平的细胞，混合后制成一批均质细胞悬液，定量分装于一定数量的细胞冻存管，保存于液氮或-130℃以下备用。这些细胞经检定证明合格后，即为工作细胞库。

不同的细胞系传代能力不同，因此，研究人员须根据自己的细胞系确定工作细胞的传代次数。

▲ 细胞库建立流程图

细胞库的检定

上面我们介绍过在进行各级细胞库的建立时，都要进行检定，合格后才可成为相应细胞库。细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别，细菌、真菌检查，支原体检查，细胞内外源病毒因子检查，致瘤性检查，必要时还须进行细胞染色体、细胞生长特性、细胞均一度及稳定性检查。

▽ 细胞检定项目

在建立这些细胞库的过程，冻存这个操作步骤是非常重要的，必须要遵守“慢冻"原理。

当建立好各级细胞库后，重要的是要如何进行管理？细胞库的管理

研究人员应检测并维护细胞库冻存器，以保证细胞库贮存在一个高度稳定的环境中。每种细胞库均应分别建立台账，详细记录放置位置 ，容器编号，分装及冻存数量，取用记录等。细胞库中的每支细胞冻存管均应具有细胞系/株名、代次、编号、冻存日期、贮存容器编号等信息。

▽ 细胞系记录表

为保证细胞冻存后仍具有良好的活力，每建立一级细胞库，冻存前的细胞活力应不低于90%，冻存后应取一定量的（可代表冻存全过程）冻存管，复苏细胞进行检测，复苏后细胞的活力应不低于80%。一般细胞冻存2-3天温度趋于稳定后，即可进行细胞活力检测。

▽ 细胞复苏记录表

那么我们在建立细胞库的时候，应该如何确定冻存数量和冻存密度呢？

原始细胞库、主细胞库和工作细胞库冻存多少数量，可根据自己的需要确定，只要满足后续科研实验需求即可，即遵循“够用原则"。一般经验来说，冻存的细胞密度为1-10×10^{6 cells/ml，冻存体积1-1.5 ml/管。}

一些细胞冷冻保存细胞密度 ：

1. Normal human fibroblast（人成纤维细胞）：1-3×10^{6 cells/ml。2. Hybridoma（杂交瘤细胞）：1-3×106 cells/ml。3. Adherent tumor lines（贴壁肿瘤细胞系）：5-7×106 cells/ml，依细胞种类而异。Adenocarcinoma（腺癌细胞）解冻后须较高之密度，而HeLa只需要1-3×106 cells/ml。4. Other suspensions（悬浮细胞）：5-10×106 cells/ml。5. Human lymphocyte（人淋巴细胞）：至少5×106 cells/ml。}