测序实验流程你真的懂嘛？

1、收集样品

2、相关试剂 总RNA提取试剂TREzol Reagent (RNA提取试剂), M-MLV(cDNA逆转录酶), RNA 纯化试剂, RealqPCR MasterMix (荧光定量PCR预混试剂)。

3、实验仪器 荧光定量PCR仪; PCR仪;低温离心机。

4、总RNA提取

5、cDNA合成 在0.5ml的离心管中加入1µl模板总RNA(1µg/µl); 2µl随机引物(T18, 10pmol/ul);2µl 10mM dNTP mix;加水至15µl体系。混匀后70℃变性RNA 5分钟，冰上速冷1分钟，离心将溶液收集至管底加入6µl 5×PCR buffer;1µl RNaseout;1µl M-MLV RT;加水至30µl体系。PCR仪中反应条件设置 37℃延伸60min，70℃保温15min终止反应。合成好的cDNA置于 -20 ℃保存备用。

6、引物设计与thermal cycler protocol thermal cycler protocol合成

7、实时定量PCR 按以下反应体系进行: 2x RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25ul;上游引物F 1 ul，下游引物R 1 ul;cDNA template 2ul。定量PCR仪扩增反应条件设置:50 ℃ 2min ;95 ℃ 10min ;95℃ 15s --60 ℃ 60 s (40个循环)。

8、PCR产物溶解曲线分析 将所扩增的PCR 产物进行溶解曲线分析，单峰溶解曲线表示扩增产物单一，无非特异性扩增产物。溶解曲线生成的反应程序为: 95 ℃ 15s , 60 ℃ 15 s , 95 ℃ 15s。

注意事项：收集标本前必须清楚要检测的成份是否足够稳定，对收集后当天进行检测的标本，储存在4℃备用，如有特殊原因需要周期收集标本，将标本及时分装后放在-20℃或-70℃条件下保存。避免反复冻融，标本2-8℃可保存48小时，-20℃可保存1个月，-70度可保存6个月，部分标本需添加抑肽酶。