病毒核酸检测标准化：标准物质的种类及制备

病毒核酸检测(nucleic acid test，NAT)现已广泛应用于血液及其制品的病毒筛查、临床抗病du药物治疗疗效监测等。但核酸检测容易受到检测样本的基质效应和检测病毒的基因变异等多种因素的影响，使得不同的实验室应用不同的方法学进行核酸检测的结果，在量值、灵敏度和特异性方面常出现较大的差异。为使不同实验室，不同方法间检测的结果具有可比性，就必须使检测标准化， 而标准物质是检测标准化的核心。

标准物质的种类

由于血清中病毒核酸的量值不能单独应用物理和(或)化学的方法进行准确测定，必须通过一定的核酸扩增或杂交过程并经相应的数据处理后才能推测出血清中病毒核酸的原始数值。所以传统意义的一级参考测量程序(物理和化学方法)和一级标准物质在核酸检测中还不存在。病毒核酸检测标准物质目前通常分为国际标准物质、国家或地区标准物质和实验室内部的工作制剂等三个等级。1.核酸检测用国际标准物质(reference material)是指由WHO 多中心研究后由专门委员会认可的，经过稳定性和组成完整性检验的，在国际范围内用作有关量的其他标准定值基础的物质，目前均由英国国家生物学标准物质和质控物研究所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)研制并提供。NIBSC于1997年建立了第一代HCVRNA 核酸检测用国际标准，分别于1999年、2000年、2002年和2003年建立了第一代HIVG1 RNA、HBV DNA、Human parvovirus B19和HAV RNA 核酸检测用国际标准(表9G1)。核酸检测用国际标准物质没有高纯度要求，其产量也没必要满足常规实验室要求，通常制备一批次可供5～10年应用。2.国家或地区标准物质主要面向一个国家或地区。在有国际标准物质的情况下，可溯源至国际标准，如卫生部临床检验中心研制的HBV DNA 和HCV RNA 国家标准物质。在没有国际标准的情况下，国家标准物质管理组织可以建立国家标准物质并自行规定单位，诸如意大利HCV RNA 国家标准物质。3.实验室内部用的核酸检测工作制剂是指相关诊断试剂生产厂家，在实际工作中用于校准或检查实物量具、测量仪器或标准物质的工作标准。如Roche、Chiron 和Bayer等公司自己用的核酸检测工作标准国家或地区标准物质和实验室内部的工作制剂等的量值应溯源至国际标准物质。其测定值的不确定度也应大于并包含上一级标准物质的不确定度。标准物质的制备目前，病毒核酸检测用国际标准物质的制备已经程序化，HCV RNA、HIVG1 RNA、HBV DNA、Humanparavo virus B19和HAV RNA的第一代国际标准物质，都是按照WHO 的固定程序制备的。其过程包括原材料的选择和分装、稳定性和均匀性检验、多中心合作研究定值、WHO认可三个阶段。下文就原材料的选择和分装进行介绍。一、原材料的选择原则在选择用于制备病毒核酸标准物质的原材料时，通常应该遵循如下基本原则。1.基质相同或相近的原则核酸检测用标准物质所选的原始材料，基质应和使用的要求相一致或尽可能接近，这样可以消除方法基质效应引入的系统误差。如临床日常检测的标本使用的是血清(浆)，则相应标准物质的基质也应是血清(浆)；如临床标本的基质为细胞，则标准物质的基质亦应为细胞。目前WHO认可的核酸用国际标准物质所选的原始材料，是应用混合的阴性血浆[HBGsAg(-)、抗HCV(-)、HCV RNA(-)、HIV 抗原检测(-)、HIVG1 RNA(-)、HAV RNA(-)和Parvovirus B19(-)]稀释阳性血浆得到，阳性血浆中含有相应经过灭活处理的野生型病毒。2. 原始材料的均匀性原则由于原始材料可能为多个来源，因此必须严格混匀以保证材料的均匀性。原始材料可以分成相同的几份或不同的几份，一次制备两批次或多批次的候选国际标准物质，如NIBSC在制备第一代HCV 核酸检测用国际标准时，除制备了两批次冻干粉候选标准物质外，还制备了一批次的液体候选标准物质，这样可以监测制备过程对标准物质的影响是否相同和选择国际标准的最佳保存形态。3.有代表性及靶病原体含量高的原则筛选的自然存在的病毒应具有代表性，并且目的分析物含量要高。要注意病毒的不同的基因型的分布、病毒核酸常用于核酸扩增检测区域的保守性，避免使用含有已发生变异的特殊病毒的原材料。4.容易大量获得易大量获得，可有效地保证标准物质的制备原材料有足够的来源，一次也可大量制备，也可有效地保证成品的均一性。5.无纯度要求用于病毒核酸制备的原材料可以是纯的病原体或培养物，也可以是混杂在临床标本的混合物，只要其基质中不含影响检测的物质即可。6.生物安全性用于病毒标准物质制备的原材料一般均来自于感染者的标本，均具有生物传染危险性，因此，在不影响靶核酸的稳定性的情况下，应尽可能在制备前进行灭活处理。理想情况下，是采用无生物传染危险性的原材料如体外克隆表达的病毒样颗粒来制备。7.防污染处理原始材料时，要注意防止物理、化学和微生物方面的污染。8.人工合成的病毒核酸的筛选选择人工合成的病毒核酸作为相应标准物质制备的原材料时，合成核酸片段序列选择、长度和理化特性应适用于临床使用的商品试剂盒，特别要注意的是适用于不同的核酸纯化方法。其生物安全性、易获得性、使用的方便程度均应明显好于天然候选物。但裸露的RNA 容易受核糖核酸酶的降解而稳定性差。二、原材料的分装标准物质在液体分装时，会造成分装体积的不均匀。因此在分装过程中，每隔一定数量都会抽取一分装单位进行称量，并通过称量结果计算分装的变异系数。如NIBSC在制备病毒核酸检测用HAV RNA、HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA和B19 DNA国际标准时，采用称重的方法确定分装的不确定度分别为0.29% 或0.39%、3.2%、0.4%和0.6%、0.63%和0.71%。并在分装时尽量避免生物的，化学的或灰尘污染，操作可以在清洁级的房间内操作或在配备高效微粒空气过滤器的层流柜中操作。分装应尽快在短时间内完成，以确保同一批次所有的分装单元是在同一时间同样条件下分装。此外，分装用分配器、检测用仪器均应进行校准。所有用于制备的玻璃器皿或一次性消耗品均应经过高压灭菌消毒。用于制备RNA的玻璃器皿应经过去核糖核酸酶的处理，一次性消耗品应为无脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的制品。