化学品快速生物降解性测试标准
1．我国的化学品快速生物降解性测试标准
化学品快速生物降解性是受试物质（有机物）在限定时间内与接种微生物接触表现出的生物降解能力，是根据化学物质的环境危害性和持久性进行分类来评价和控制环境风险的基本指标。通过标准测试方法得到的结果表明该受试物质在环境中被迅速地生物降解，可列为“易生物降解”类物质。
对于化学品的快速生物降解性，国际上采用经济合作与发展组织（OECD）的OECD No.301中规定的六种经典快速生物降解性测试方法，即：溶解性有机碳（DOC）消减试验（OECD No.301A），二氧化碳（CO2）二氧化碳产生试验（OECD No.301B），改进的MITI（I）试验（OECD No.301C），密闭瓶试验（OECD No.301D），改进的OECD筛选试验（OECD No.301E）和呼吸计量法试验（OECD No.301F）。
我国结合国内实际情况于2008年分别将OECD的OECD No.301六种经典方法等同转化为六项国家推荐标准。概述各方法技术要点的GB/T27850-2011《化学品快速生物降解性通则》于2012年8月1日实施；但2006年在“OECD No.301B：二氧化碳（CO2）产生试验”基础上推出的新方法“OECD No.310：密闭瓶二氧化碳（顶空试验）法”，目前尚未转化为我国国家推荐标准。
我国根据OECD No.301的六种经典方法标准转化的相关化学品快速生物降解性测试国家推荐性标准，就是我们对化学品的快速生物降解性进行评价的方法。我国与OECD No.301的六种经典化学品快速生物降解性测试标准对比见表1。
2．快速生物降解性测试标准的相关规定
GB/T27850-2011和经合组织OECD No.301中六种测试方法的共同原理是：将含受试物质的无机培养基溶液或悬浮液接种微生物后，以受试物质作为唯一的有机碳源，在黑暗或散射光条件下好氧培养。通过空白对照组来校正接种微生物内源呼吸引起的误差。试验通常持续28d，在28d培养期结束后，通过溶解性有机碳的消减、CO2产生量或O2消耗，以评价受试物的快速生物降解性。
若试验DOC的去除率达到70%，或生物降解耗氧量达到理论需氧量（ThOD）的60%，或CO2产生量达到理论二氧化碳产生量（ThCO2）的60%，即认为达到快速生物降解的通过水平。28d内的生物降解率或10d观察期（观察期窗口从DOC、ThOD的去除率达到10%，或CO2产生量达到ThCO2的10%开始；为减少取样和烧瓶的数量，某些情况可采用14d观察期）的降解率达到通过水平，可认为受试物具备快速生物降解性；如果在28d后达到通过水平，则不具备快速生物降解性。
受试物质必备信息是：试验前必须已知或测得受试物质的溶解度、蒸汽压和吸附性，并以此选择最合适的测试方法；若掌握受试物质的相关信息如理论需氧量（ThOD）、理论二氧化碳产生量（ThCO2）、DOC、总有机碳（TOC）和化学需氧量（COD），可选择合适的试验浓度、计算降解参数的理论值或对测定值进行验证。
参比物质是：新蒸馏的苯胺、醋酸钠或苯甲酸钠，可选其中一种作为程序对照组和毒性对照组进行平行试验。
试验用水要求：每组、每系列试验，必须使用同一批水。试验用水必须是高纯度去离子水或蒸馏水，不含对微生物有毒害作用的物质如（Cu2+），以减少对接种微生物的抑制。
各测试方法的适用范围：若某受试物质在水中的溶解浓度不低于100mg/L，而且在水中不易挥发，不被玻璃瓶壁和连接管吸附，这六种方法都适用。对难溶于水（水中溶解浓度<100mg/L）、易挥发和易吸附的化学物质，测试方法的适用范围见表2。
由表2可知，对一般的难溶于水、易挥发、易吸附的受试物质，可以从GB/T 21802-2008、GB/T 21831-2008、GB/T 21801-2008三种方法中选一种进行试验。GB/T 21803-2008和GB/T 21857-2008两种方法适用范围有限，不能用于一般的难溶于水、易吸附、易挥发的受试物质的测试。虽然对于一些中等挥发性的受试物质，可在保证试验容器密闭、预留足够顶部空间并建立无菌对照组等前提条件下，采用GB/T 21802-2008和GB/T 21857-2008方法进行试验，但由于操作复杂，干扰因素多，不如选择其他方法。
六种快速生物降解性测试标准规定的仪器设备、操作要求见表3。
六种快速生物降解性测试标准规定的对受试物浓度的要求，见下表4。
3．六项快速生物降解性测试标准的注意事项
3.1 GB/T 21803-2008（OECD No.301A-1992）注意事项
GB/T 21803-2008/301A适用于难挥发、易溶于水（水中溶解度不低于100mg/L）、不易吸附的化学品的快速生物降解性。试验以活性污泥、污水处理厂出水、地表水和土壤或以上几种的混合物为接种物。其原理是在一定体积已接种的无机培养基中，反应容器中受试物的DOC浓度应控制在10～40mg/L，在温度为（22±2）℃、反应容器用铝箔封口，内外空气可以自由交换，黑暗或散射光条件下曝气培养。
28d培养期间，以固定时间间隔测定DOC，用DOC去除浓度，计算受试物快速生物降解率。在试验进行到14d时，参比物程序对照的降解率（以DOC计）应不低于70%。若试验结束时DOC的去除率达到70%，即认为受试物达到快速生物降解的通过水平。通过化学分析测定试验开始和结束时受试物浓度，可以确定受试物的初级生物降解性。
3.2 GB/T 21856-2008（OECD No.301B-1992）注意事项
二氧化碳生成法适用于可溶于水或难溶于水的、不挥发的或有吸附作用的化学品的快速生物降解性。如果反应容器中有机碳浓度过低，将影响测试精度；如果有机碳浓度过高，将增加CO2吸收瓶的数量，以及Ba（OH）2或NaOH的用量。因此，该方法反应容器中受试物的有机碳浓度（DOC或总有机碳TOC，难溶物质以悬浮液计）应控制在10～20mg/L。对于难溶物质，试验过程中通过磁力搅拌保持悬浮状态。
其原理是在一定体积已接种的无机培养基中，含有已知浓度的受试物（10～20mg/L，以溶解性有机碳DOC或总有机碳DOC计）作为唯一的有机碳源，在黑暗或漫射光下，用脱二氧化碳的空气，以受控速率（30～100mL/min）对试验培养基进行曝气，用Ba（OH）2或NaOH溶液吸收反应产生的CO2，通过滴定剩余碱液或测定无机碳计算CO2的浓度，测定28d二氧化碳产生量来确定降解率。受试物产生的二氧化碳数量用CO2理论生成量（ThCO2）的百分率来表示。经只含接种物的空白试验校正，生物降解率也可采用接种开始和结束时进行的补充DOC测定值来计算。
试验以活性污泥、污水处理厂出水、地表水和土壤或以上几种的混合物为接种物。为确保数据的可靠性，在试验进行到14d时，参比物程序对照的降解率（以ThCO2计）应不低于60%。要求试验培养基中无机碳含量在试验开始时应低于总碳的5%，试验结束时接种物空白对照中CO2生产总量通常不高于40mg/L，高于40mg/L时，应对数据和试验方法进行检验。
3.3 GB/T 21802-2008（OECD No.301C-1981）注意事项
该测试方法最初是日本通商产业省（Ministry of International Trade and Industry，MITI）开发的方法。该方法具有显著优点，被很多国家采用。该方法采用专用的呼吸测定仪，配备六个作为反应容器的300mL烧瓶，其中三个作为接种受试物质组，三个作为空白对照组。该方法可测试可溶于水或难溶于水、吸附性、易挥发性化学品的快速生物降解性（对于易挥发性物质，应尽量减小试验烧瓶上部气体空间的体积）。
其原理是受试物溶解或悬浮在试验培养基中，加入未经驯化的接种物，在黑暗密闭、搅拌和（25±1）℃条件下培养28d，用碱石灰吸收产生的二氧化碳，连续测定耗氧量。受试物生物降解时接种物耗氧量经平行试验空白对照校正后，以占理论需氧量（ThOD）的百分数表示降解率。另通过测定试验开始和结束时受试物浓度，可以确定受试物的初级生物降解性。
通过DOC分析，可确定受试物最终生物降解率。从不少于10个使用和排放各种化学物质的场所（包括城市污水处理厂、工业污水处理厂、河流、湖泊和沿海）采取活性污泥作为接种物，并要求在试验进行到7d和14d时，参比物的降解率应分别高于40%和65%，且接种物空白对照组的耗氧量通常要求在20～30mg/L（以O2计），28d试验期间，氧消耗不高于60mg/L（以O2计），若氧消耗量大于60mg/L，应复查。若pH值超出6～8.5，且受试物氧消耗量低于60%，则设置较低的受试物浓度，重新试验。该方法采用电解法连续供氧系统，因此该方法基本不受溶解氧变化的限制。
3.4 GB/T 21831-2008（OECD No.301D -1981）注意事项
该法以BOD瓶作为反应容器，适用于评价可溶于水或难溶于水的、不挥发性、挥发性或有吸附作用的化学品的快速生物降解性。在含有2～5mg/L受试物的试验培养基中接种少量的接种物，在恒温避光条件下保持受试物溶液完全充满密闭瓶。受瓶中液体溶解氧的总量限制，且为保证溶解氧测定精度，应始终保持DO浓度≥0.5mg/L。根据在28d中溶解氧的消耗来计算降解率。受试物生物降解时接种物消耗的氧量经平行试验空白对照校正后，以占理论需氧量ThOD或COD的百分数表示降解率。
试验以污水处理厂生活污水的活性污泥、二级出水或地表水为接种物。为确保接种物的活性，BOD瓶中溶解氧浓度不得低于0.5mg/L，通常使受试物浓度限制在2mg/L以内，一般从受试物的理论需氧量ThOD（mg/mg）可估计大致的最高浓度。对不易降解的和理论需氧量ThOD较低的化合物，浓度可设置在5～10mg/L。在试验进行到14d时，参比物程序对照的降解率（以占ThOD的百分数计）不得低于60%。
试验期间，试验瓶中溶解氧的残余浓度不得低于0.5mg/L，而28d试验结束后，接种物空白对照的溶解氧损耗不高于1.5mg/L。其中，空白对照的氧消耗量对试验的有效性非常重要。
对于缺乏毒性信息，且未预先测试活性污泥呼吸抑制作用的受试物，为得到可靠的测试结果，最好选择2mg/L和5mg/L两个受试物浓度同时进行试验。只要其中一个浓度的试验在10d观察期或14d达到通过水平，即可认为该受试物具有快速生物降解性。对于含氮的受试物，需校正硝化作用的影响。
3.5 GB/T 21857-2008（OECD No.301E-1992）注意事项
该法适用于测试难挥发、不易吸附、水中溶解度不低于100mg/L的化学品的快速生物降解性。在一定体积的无机培养基中加入已知浓度的受试物（10～40mg/L，以DOC计）作为唯一的有机碳源，每升培养基接种0.5mL污水处理厂二级出水的滤液。在温度为（22±2）℃、黑暗或散射光的条件下进行曝气。在28d内，定期测定DOC以确定降解率。
生物降解率用DOC去除浓度（用接种无的空白对照试验校正）计算，以初始浓度的百分比表达。可以通过特定化学分析测定试验开始和结束时受试物的浓度，确定受试物的初级生物降解性。试验以水处理厂或中试规模的污水处理装置的二级出水为接种物。为保证试验的有效性和质量，要求试验进行到14d时，参比物程序对照的降解率（以DOC计）不小于70%。
3.6 GB/T 21801-2008/OECD No.301F-1992注意事项
呼吸计量法适用于多数化学物质的快速生物降解性的测试与评价，对于一般难溶于水、易挥发、易吸附的化学物质同样适用。向一定体积并已接种的无机物培养基中加入适量受试物（100mg/L受试物至少预留50～100mg/L的理论需氧量）作为唯一的有机碳源，密闭烧瓶后在恒温下连续进行磁力搅拌28d。
通过测定为维持呼吸烧瓶内气压而电解产生氧气的量，或者用仪器测定瓶内气体体积或压力（或两者）的变化，可得到耗氧量。释放的二氧化碳用氢氧化钾溶液或其他适当的吸收剂吸收。受试物浓度（难溶物质以悬浮液计）一般为100mg/L，但ThOD要保持在50～100mg/L。在受试物生物降解过程中（用平行试验中的空白接种物的摄入来校正），微生物种群吸收氧的量以ThOD的百分率表示，或用效果略差的COD来表示。
另外，通过化学分析测定试验开始和结束时受试物浓度，可以确定受试物的初级生物降解性。通过DOC分析，可以确定受试物的最终生物降解率。
试验以活性污泥、污水、地表水和土壤或以上几种的混合物为接种物。在试验到14d时，要求参比物程序对照的降解率以DOC计不低于70%，以ThOD计不低于60%；且要求接种物空白对照组的耗氧量通常在20～30mg/L（以O2计），28d试验期间，氧消耗不高于60mg/L（以O2计），若氧消耗量大于60mg/L，应复查。若pH值超出6～8.5，且受试物氧消耗量低于60%，则设置较低的受试物浓度，重新试验。对于含氮的受试物，计算ThOD时需校正硝化作用的影响。
4．结语
（1）GB/T27850-2011和经合组织OECD No.301系列标准提供了六种测试化学品快速生物降解性的经典方法，测试时可根据受试物质选择适用的方法。
（2）GB/T 21803-2008（OECD-301A）适用于易溶于水、不易挥发、不易吸附的物质；GB/T 21856-2008（OECD-301B）不适用于易挥发的物质；GB/T 21857-2008（OECD-301E）适用于易溶于水、不易挥发、不易吸附的物质；GB/T 21802-2008（OECD-301C）、GB/T 21831-2008（OECD-301D）、GB/T 21801-2008（OECD-301F）三种方法测定含氮受试物质时，要校正硝化作用的氧消耗。
（3）GB/T 21803-2008、GB/T 21856-2008、GB/T 21802-2008、GB/T 21831-2008、GB/T 21857-2008、GB/T 21801-2008六种快速生物降解性测试标准对设备和操作的要求各有不同，对受试物质浓度要求也不尽相同，应根据受试物质的特性、浓度和测试机构仪器、设备、场地等条件，设计出有针对性的试验方案，采用合适的反应装置，保证试验结果的准确。
化学品的种类繁多，性质各异，测试周期长，程序复杂，对测试人员的专业知识和操作能力也有很高的要求。测试人员应通过对化学品生物降解性的测试和对有机物化学结构与其毒性关系的深入研究，严格按照各种规定的方法要求，认真操作，细心观察，排除干扰，使化学品生物降解性的评价方法会日趋完善，为开发环境友好化学品提供支持，对保护环境作出贡献！
