水果及其制品中棒曲霉素的残留分析进展
入世以来, 农产品出口不断受到“绿色贸易壁垒”的困扰, 水果及其制品的出口也不例外。棒曲霉素是由水果腐烂部位的真菌类产生的次生代谢产物。由于棒曲霉素的致突变性和致畸性并可能对消费者的健康产生危害, 许多国家都已制定了相关标准以尽可能降低水果制品中棒曲霉素的含量。为此, 对水果及制品中棒曲霉素的残留分布、毒性限量、分析检测方法及其研究新动向进行了综述。 关键词:棒曲霉素; 残留; 检测; 水果及其制品。
我国是水果及其制品生产和贸易的主要国家之一, 但由于我国采用的原料往往是生长期和收获期的残次落果, 原料的成熟度、健康度、新鲜度都无法控制, 因而与国外同行业相比, 我国水果制品存在许多质量问题。入世以来, 欧盟、美国、加拿大、日本以及韩国等国家/地区对我国出口的水果制品采取的技术性及贸易性壁垒限制措施空前加大, 其中棒曲霉素超标问题已成为近几年出口的主要阻碍。本文就水果及其制品中棒曲霉素的残留分布、毒性限量、分析检测技术作一综述。
1 残留与分布
棒曲霉素是属于真菌毒素的一类有毒化合物, 主要是青霉属、曲霉属、裸囊菌属等多种真菌的次生代谢产物, 主要存在于霉烂苹果和苹果汁中, 是影响水果及果汁饮料质量的主要因素之一, 棒曲霉素含量已成为水果加工产品的质量指标之一。水果制品中的棒曲霉素主要来源于青霉菌, 此菌危害成熟或接近成熟的果实, 当条件适宜时, 10 余天全果腐烂。腐烂程度越高, 棒曲霉素含量越高。研究表明, 水果腐烂部位周围大约1cm的健康组织也有棒曲霉素残留。因此去除腐烂部位不能将烂果率完全控制, 在水果腐烂率较高的季节, 棒曲霉素含量较高, 由于棒曲霉素分子小, 易溶于水, 且热稳定性高, 在水果制品加工过程中, 过滤及杀菌等工艺不能将其去除干净, 因此在水果制品中也有残留。检测并有效控制水果制品中棒曲霉素的含量是发展我国果品加工业的当务之急。
2 毒性及限量
毒理学试验表明, 棒曲霉素具有致畸、致癌和致突变作用[7~9], 英国食品、消费品和环境中化学物质致突变委员会已将棒曲霉素划为致突变物质。FAO/WHO 食品添加剂委员会( JECFA) 的一份研究报告表明, 棒曲霉素对胚胎有毒性, 同时伴随有母体毒性。虽然, 最近对大鼠的研究不能说明它有免疫毒性, 但是已经证实, 相对高剂量的棒曲霉素有免疫抑制作用。棒曲霉素还能改变细胞膜的通透性, 可抑制细胞中大分子物质合成, 并能造成细胞中非蛋白质巯基耗竭, 导致细胞活性丧失。
所以, 从20 世纪60 年代, 棒曲霉素就引起了人们的重视, 世界各国卫生毒理学、食品生产和安全等各方面专家学者对其给予了极大的关注。为了建立人类对棒曲霉素的安全指南, JECFA 最近将其最大日可食入量从1 μg/kg.b.w/d 降为0.4 μg/kg.b.w/d。JECFA 规定水果及加工产品中棒曲霉素的含量应低于25 μg/kg。鉴于棒曲霉素的毒性及其污染情况,目前, 世界上已有十几个国家制定了水果及其制品中棒曲霉素的最高限量标准。
国际上建议人类食用的苹果产品中的棒曲霉素残留量小于50 μg/kg, 而很多国家将果汁中的棒曲霉素残留量调整在20 μg/kg～50 μg/kg 之间。据设在国家质检总局的中国WTO/SPS 国家咨询点发布的消息, 欧盟委员会近期通过第455/2004 号指令, 对含苹果汁饮料中棒曲霉素最大限量制定了新的标准———果汁、特别是苹果汁及含苹果汁的酒精饮料中最大限量为50 μg/kg, 固体苹果产品中最大限量为25 μg/kg, 儿童用苹果汁和婴儿食品中最大限量为10 μg/kg。该条例宣布自4 月起生效, 并即时在欧盟各成员国实行, 无须再转化为成员国的本国规定。
3 分析检测方法
自从在水果中发现棒曲霉素起, 对其有效检测方法的研究已引起人们的高度重视。我国对棒曲霉素的研究较晚, 测定棒曲霉素含量最初采用微生物法、薄层色谱法( TLC) , 后来发展有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC) 。其中HPLC 法是目前国内外较为普遍采用的方法。
3.1 微生物方法用大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌做试验生物体, 在平板上测量。Stott等用Bacillus megaterium NRRL 1 368 对棒曲霉素进行了检测, 试验结果表明: Bacillus megaterium NRRL1 368 对棒曲霉素的反应在2 ng/L～80ng/L 之间成线性关系, 其最低检测值为117 ng/L, 检测时间是12 h～15 h。这种方法的缺点是: 较费时、灵敏度不高。但它作为一种定性方法还是比较适用的。
3.2 薄层色谱法( TLC) 苹果汁中棒曲霉素比较早的检测是采用TLC 方法, 最初的AOAC 方法是1974年通过的。中华人民共和国国家标准《苹果和山楂制品中棒曲霉素限量卫生标准》(GB14974- 94) 规定了棒曲霉素的检测采用TLC 方法。TLC 方法包括乙酸乙酯提取、净化、浓缩、薄层展开后, 利用薄层扫描仪进行紫外反射光扫描定量。该方法适合检测污染苹果中的棒曲霉素。
棒曲霉素的回收率为78%, 其缺点是:
(1) 费时, 并且只能提供半定量结果。
(2) 有共萃取现象, 尤其是与5- 羟甲基- 2- 糠醛(HMF) 有共萃取现象。
(3) 灵敏度较低, 检测限量为20mg/L。
目前果汁行业中已几乎没有使用此方法检测棒曲霉素残留的。
3.3 高效液相色谱法(HPLC) HPLC 是目前使用最广泛的用于分析水果中棒曲霉素的方法, 且多使用反相液相色谱分析[17]。由于HPLC 检测方法更方便、快速, 所用溶剂更少, 因此, 关于用HPLC 对棒曲霉素进行检测的研究越来越多, 此方法已成为检测棒曲霉素的标准方法。
乙酸乙酯被广泛地作为萃取用溶剂, 而净化系统已不断得到发展。HPLC 检测的灵敏度较高, 检测限和回收率较为满意。
出口果汁饮料中棒曲霉素的检测现多采用SN0589- 1996 标准: 乙酸乙酯振荡萃取, 碳酸钠水溶液净化, HPLC 测定的方法。这也是国外目前主要采用的检测方法。该方法并不是理想的分析方法, 其缺点是: 偏碱性的碳酸钠水溶液净化操作会造成棒曲霉素损失, 净化效果差, 回收率低, 该法操作烦琐, 溶剂用量大, 对操作者及环境危害大。因此, 迫切需要研究新的快速、高效的前处理方法。
3.4 气相色谱法(GC) 尽管HPLC 法检测棒曲霉素更好, GC 方法也得到了一定的应用。其中包括三甲基硅烷化衍生物的制备, 采用ECD 或MS 检测。最近的研究包括采用相应的咪唑类进行七氟丁酸盐衍生物的制备。色谱分离采用毛细管色谱柱和ECD检测器。检测线性范围为0.05～0.5 ng, 而且重复性高。采用该技术对天然污染的果汁饮料进行乙酸乙酯提取和硅胶柱纯化后, 检测限为10 μg/L。
4 讨论
目前, 国内的检测部门和科研单位主要是采用传统的液液萃取方法( LLE) , 即乙酸乙酯萃取, 并用碳酸钠水溶液净化, HPLC 测定, 这也是国外主要采用的方法。国外将固相萃取( SPE) 技术用于苹果汁中棒曲霉素的提取和纯化, 但分析报道很少, 在一项样品制备技术中, 一种商业多功能纯化柱(MycoSepcolumn, Romer Labs, Union, MO, USA) 已用于分离果汁中的棒曲霉素, 柱子吸附干扰杂质, 而棒曲霉素则通过柱子, 回收率在82%～96%之间。一些新的前处理方法, 如固相微萃取、基质固相分散等方法尚未应用到棒曲霉素的前处理分析中。
研究检测方法并有效控制浓缩苹果汁中棒曲霉素的含量是发展我国水果制品加工业当务之急。
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