蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐与硝酸盐的HPLC法测定
目的:建立蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐与硝酸盐的高效液相色谱同时测定方法。
方法:样品中亚硝酸盐与硝酸盐用超纯水浸提或超声提取, 经活性炭脱色后过滤或离心沉淀, 滤液或上清液经0.45 μm水相膜过滤后进样, 在PhenomenexSAX色谱柱上, 以0.01 mol/L磷酸二氢钾为流动相进行分离, 205 nm检测, 外标法定量。
结果: 该法最低检出量分别为亚硝酸盐氮0.1 mg/kg、硝酸盐氮0.07 mg/kg。样品加标回收率, 亚硝酸盐为91.0% ～ 101.9%、硝酸盐为94.7% ～ 106.0%, RSD<5% 。
结论: 该方法操作较简单, 灵敏度高, 速度快, 干扰少, 结果准确, 适用于蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐与硝酸盐的同时测定。
[关键词] 高效液相色谱法; 蔬菜、水果及其制品; 亚硝酸盐; 硝酸盐
蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐和硝酸盐的标准测定方法是GB/T15401 -1994“水果、蔬菜及其制品亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定”和GB/T5009.33 -2010 食品安全国家标准“食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定” , 两标准均采用盐酸萘乙二胺直接显色法和镉柱还原法测定;其中GB/T5009.33 -2010食品安全国家标准新增了离子色谱法。在标准检测方法中, 硝酸盐的测定, 化学比色法需通过镉柱还原为亚硝酸盐;离子色谱法需将样品提取液经多种预处理小柱处理后才能进样且出峰时间较长, 操作均较繁琐。本研究根据实际, 将样品中亚硝酸盐和硝酸盐用去离子水浸提, 活性炭脱色后过滤或离心沉淀, 滤液或上清液经0.45 μm水相膜过滤, 滤液直接进样, 205 nm紫外检测, 结果准确、快速, 能同时测定蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐和硝酸盐。
1 材料与方法
1.1 仪器
Agilent1100液相色谱仪(美国安捷伦公司), 包括Agilent ChemStation工作站、四元梯度泵、真空脱气箱、恒温柱温箱、紫 外检测器。
MilliporeMilli-Q纯水系统(Molsheim France);Orion828型pH计(USA);IKAT25 可调高速匀浆机(德国);SB2200超声波清洗器(上海Branson);水浴箱;离心机(4000 r/min);
JY5002型电子天平(精度0.01 g, 上海精宏科器)。
1.2 试剂
0.01 mol/L磷酸二氢钾(HPLC级, 10% 磷酸调pH至3.2);10%磷酸;220 g/L乙酸锌;106 g/L亚铁氰化钾;超纯水(电阻率为18.2 MΨ· cm);
标准储备液:称取优级纯亚硝酸钠0.2463 g、硝酸钠0.2963 g溶于水并定容至500 ml, 浓度为0.1 mg/ml(以氮计,下同)。
1.3 色谱条件
检测波长:205 nm;色谱柱:PhenomenexSAX 80A (250 ×4.6 mm 5 μm);流动相:0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液(pH =3.2);流速1.5 ml/min;柱温:30℃;进样量10 μl。
1.4 实验方法
1.4.1 试样测定 取新鲜蔬菜中食用部分, 用自来水洗去泥土, 然后用去离子水漂净、凉干、切碎, 水果(去核)及其制品剁碎后, 称取50 g左右样品与水按1∶1 比例用高速匀浆机匀浆后称取10 g, 加约80 ml水, 70℃水浴提取20 min, 冷却后各加1 ml220 g/L乙酸锌和106 g/L亚铁氰化钾溶液, 水定容至100 ml, 加适量活性炭脱色, 混匀后过滤或离心沉淀。滤液或上清液经0.45 μm滤膜过滤至自动进样器样品瓶中, 进样10 μl测定。液体样品按固形物含量不等1∶1 ～ 1∶5直接用水稀释, 从冷却后按固体样品方法处理。
1.4.2 标准曲线绘制 各准确吸取0.1 mg/ml标准溶液10.0 ml于50 ml容量瓶, 用水稀释至刻度, 配成20.0 μg/ml亚硝酸盐氮、硝酸盐氮溶液, 再逐级稀释10 倍稀释成2.00 μg/ml、0.20 μg/ml、0.02 μg/ml标准系列溶液, 分别进样10 μl。以亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量为横坐标, 峰面积为纵坐标, 绘制标准曲线。
2 结果与讨论
2.1 实验条件选择
2.1.1 样品预处理
由于蔬菜、水果及其制品中蛋白质、脂肪等大分子有机干扰物质含量极低, 且此类样品中含有大量的水分, 有形成分中除纤维素外主要是一些水溶性维生素、糖类、无机盐、有机酸等小分子物质。因此, 样品中目标成分的提取与净化变得非常简单, 只需用去离子水浸提后用活性炭脱色, 以减少叶绿素等色素对测定的影响。试验了70℃水浴、不同时间直接浸提与加约70℃水后超声提取不同时间时的提取效果。试验结果表明在70℃温度时, 两种提取方法在15 min～ 60 min, 提取效果相同。标准添加回收达到91% ～106%。本法选用70℃水浴直接浸提20 min。
2.1.2 色谱条件选择
2.1.2.1 色谱柱
不同的色谱柱因性能不同对目标成分的分离能力差异很大。文献资料中测定硝酸盐与亚硝酸盐基本上采用不同品牌的C18柱或ODS柱, 因被测成分的强阴离子特性, 需用离子对试剂与硝酸根、亚硝酸根阴离子形成中性缔合物才能测定。而色谱柱对含有离子对试剂的流动相进行初始平衡时, 色谱柱吸收和释放离子对试剂的过程缓慢, 色谱柱平衡较慢, 需在确保保留值能重现后再进行测定。因此, 根据被测成分的强阴离子特性, 选用强阴离子交换柱(SAX)进行测定。
2.1.2.2 流动相 流动相对被测成分与干扰成分的分离影响主要有三个方面:流动相本身组成;流动相浓度与流速;流动相的pH值。高效液相色谱法中流动相的选择随色谱柱和分离对象的不同而不同。本方法参考文献, 分别用磷酸二氢钾溶液、甲醇-磷酸盐溶液和乙腈-磷酸二氢钾溶液作流动相, 并进行比对。试验结果表明, 文献介绍的流动相在SAX柱上对被测成份不能分离, 文献分离良好, 峰形对称,出峰快。
在其他条件相同下, 流动相用0.02 mol/L和0.01 mol/L浓度的磷酸二氢钾溶液, 目标成分的出峰时间, 低浓度时亚硝酸根和硝酸根出峰时间显著延长。如在pH3.2、流速1.0 ml/min时, 亚硝酸根和硝酸根出峰时间分别从约7.2 min、9.8 min延长到12.5 min、15.5 min, 且信号值相同。经试验,用pH = 3.2 的0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液, 流速为1.5 ml/min时目标组分间和目标组分与干扰成分间分离效果达到最佳, 且目标成分出峰时间较流速为1.0 ml/min提前到流速为1.0 ml/min流动相浓度0.02 mol/L磷酸二氢钾时相同。
流动相pH影响:由于色谱柱性能关系, 流动相的pH对目标组分分离度有很大影响。流速为1 ml/min, 0.02 mol/L磷酸二氢钾溶液pH≥ 3.7时, 目标成分间分离不完全, pH≥ 3.9两峰重叠;而用稀磷酸调流动相pH≤ 3.6 时, 两峰分离完全, 且亚硝酸根的出峰时间随流动相pH的降低明显提前, 硝酸根的出峰时间延后, 两目标组分的分离度增大, 分离更加良好。
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