肉源性实时荧光PCR探针法检测流程解读

随着经济的发展，人们对肉类的消费需求不断提高，肉类消费市场也不断扩大。由于肉类供应链范围比以前更广泛，加工方式和供应方式的多样化，市场上肉类及肉制品掺假方式也越来越复杂多样，掺假的现象严重影响着侵害了消费者的利益，扰乱了流通市场秩序和健康发展。对于消费者和监管机构而言，对肉类种类进行精准的检测显得格外重要。

传统的检测肉类与肉制品掺假的方法，如感官检验和紫外、液相和气相等色谱技术都存在一定的弊端，如耗时长、样品预处理繁杂、仪器昂贵和对操作人员要求高等。近几年新兴的检测方法，主要是近红外、远红外光谱技术和电子鼻技术，但前者需要建立模型，分析过程复杂，而后者的灵敏度和识别率较低，对检测环境的要求高。

以检测蛋白质为基础的免疫学方法，由于肉类食品中蛋白质的稳定性差、含量变化范围广，干扰因素多等原因，导致了该类方法灵敏度较低、假阳性率较高的现象。基于动物的遗传信息差异建立的实时荧光PCR检测方法，具有特异性强，灵敏度高，可达到0.1%质量比，是肉类掺假鉴定的利器。可以用于检测动物组织及肉类制品中特定动物源性成份的鉴定，具有快速、准确的特点，可进行批量样品的快速检测。
检测原理：
PCR即聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）是在体外利用聚合酶扩增特异DNA片段的一种方法，是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。实时荧光PCR（Real-time PCR)，通过在反应试剂中加入具有荧光特性的荧光探针，利用仪器的光学元件，在PCR反应过程中实时监测荧光值来确定DNA产量。

检测流程：

1.获取检测样品核酸

用相应的核酸提取试剂盒对相应的肉及肉制品进行核酸提取；

也可采用煮沸法，直接剪取少量的样品组织， 100℃加热5min，离心取上清即可；
 

2.动物源性检测试剂使用操作

a 复溶冻干阳性对照

b 复溶冻干检测试剂

c 加样

d 上机反应
3.结果分析

CT值：“S”型扩增曲线与阈值线的交点。

a.      待测样品CT值<30，有FAM荧光信号检出，并出现典型的扩增曲线，则可判断该样品含有相应的动物源性成分。

b.      待测样品CT值>35，则可判断该样品不含有相应的动物源性成分。

c.      待测样品30≤CT值≤35时，则需重复检测，再次扩增后检测体系的CT值≤35，且有典型的扩增曲线，则判定该样品含有相应的动物源性成分。当再次检测的CT值> 35，或无典型的扩增曲线，则判定该样品中不含相应的动物源性成分。