多物种种源成分的检测试剂盒特点分析

我国是世界上养猪规模最大的国家，养猪业在我国畜牧业中占有主导地位，猪肉在肉类总产量中占了绝大部分的比重，也是我们餐桌上重要的动物性食品。猪肉的营养非常全面，营养价值高，猪肉纤维较为细软，结缔组织较少，肌肉组织中含有较多的肌间脂肪；其蛋白质为完全蛋白质，含有人体必需的各种氨基酸，并且构成比例接近人体需要，易被人体充分利用，属于优质蛋白质。猪肉还含有钙、磷、铁、硫胺素、核黄素和尼克酸等营养成分，瘦肉中的血红蛋白，可以起到补铁的作用，能够预防贫血。
近年来，食品的质量安全问题越来越受到社会和监管部门的关注。食品的掺假或者说食品的欺诈已成为一个全球性问题，国际上对这样一类事件有个专门的名词，叫“经济利益驱动的掺假”。为了追求利益，一些唯利是图的生产经营者仍不择手段地在食品生产流程中施行掺假，不法商贩在市场销售中以假乱真，用低质肉冒充优质肉从中牟利，肉制品来源的安全性已成为消费者关心的焦点问题之一。随着贸易的全球化，食品的供应更需要考虑不同国家、不同文化以及不同宗教的饮食习惯，并遵循相应规则，例如猪肉在伊斯兰教、犹太教中的食用禁忌；但在我国，除了回族人之外的绝大多数人食用的主要肉制品都是猪肉。因此，针对在我国市场占有率较高的猪源性制品建立一套科学、准确、快速、低廉的检测方法是十分必要的。
本发明的目的在于针对现有技术不足，提供一种可用于猪源性制品特异性检测的引物；
本发明的第二个目的在于提供用于猪源性制品检测的检测试剂盒；
本发明的目的还在于提供猪源性制品掺假鉴定方法。
为实现上述目的，本发明从种内一致性和稳定性、种间特异性、拷贝数等方面进行猪基因组特异DNA序列的筛选，经过牛(普通牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子的基因组DNA及不同的猪品种DNA中的检测，筛选在猪中特异的、在其他物种中不存在或同源性低的DNA片段作为检测分子。经过大量分析和实验工作，最终获得可供检测使用的特异DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示。
基于此，本发明首先提供一种猪特异性引物，其特异性扩增SEQIDNo.1所示的核苷酸序列或该序列的特异性片段。
优选地，引物长度为18～27bp。引物的设计需要考虑是否容易发生错配、扩增片段长度、反应温度等多方面。
优选地，该引物序列如下：
SUS-F：5′-GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGA-3′
SUS-R：5′-TGTGCTCAAATAGGAAGGTTGTCA-3′；
或该引物向5’、3’端延伸或修饰得到的仍能特异性扩增SEQIDNo.1所示序列的引物。
进一步，本发明提供含有上述特异性引物的检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒还进一步包括以下引物中的一种或多种：
(1)对狐基因组DNA进行扩增生成狐特异性扩增片段的引物对Ⅰ：
VULPES-F：5'-ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3'
VULPES-R：5'-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3'；
(2)对水貂基因组DNA进行扩增生成水貂特异性扩增片段的引物对Ⅱ：
MUSTLA-F：5'-TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3'
MUSTLA-R：5'-AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3'；
(3)对鼠基因组DNA进行扩增生成鼠特异性扩增片段的引物对Ⅲ：
MUS_RAT_CRI-F：5’-CATCGTTGACAAGAAGGTGCTC-3’
MUS_RAT_CRI-R：5’-GAAAAAGCTGTACTTGGTGGGG-3’；
(4)对鸡基因组DNA进行扩增生成鸡特异性扩增片段的引物对Ⅳ：
GALLUS-F：5'-GCAAGGAGATGTAACCCAGTAAAG-3'
GALLUS-R：5'-AGAATCAATCAGAAAAATGAAGCC-3'；
(5)对鸭基因组DNA进行扩增生成鸭特异性扩增片段的引物对Ⅴ：
ANAS-F：5'-GTCAACGATTGCCCCGAAAC-3'
ANAS-R：5'-GGGGACTTTGACGGCATCTT-3'；
(6)对马属基因组DNA进行扩增生成马属特异性扩增片段的引物对Ⅵ：
EQUUS-F：5'-TGGCTCTGAAGATGATGAGGCTG-3'
EQUUS-R：5'-GAGGCAATGATTTTGTTCTGCGT-3'。
优选地，所述试剂盒还包括下述试剂中的一种或多种：其还包括下述试剂中的一种或多种：Taq酶、dNTPs、MgCl2、PCR缓冲液、阳性对照DNA模板、双蒸水；或者还包括下述试剂中的一种或多种：TaqDNAMasterMix、阳性对照DNA模板、双蒸水。
所述阳性对照的模板为猪科猪属的猪基因组DNA模板；
优选地，所述阳性对照DNA模板还包括狐、水貂、小鼠、大鼠、仓鼠、鸡、鸭、马、驴DNA模板中的一种或多种。
进一步，本发明提供上述的猪特异性引物或检测试剂盒在猪源性成分鉴定或猪源性制品掺假检测中的应用。
本发明还提供一种猪源性成分鉴定及其制品中多物种种源成分的PCR检测方法，其步骤如下所述：
1)提取样品基因组DNA；
2)PCR扩增：
A)用所述的猪特异性引物进行PCR扩增，并以猪基因组DNA模板为阳性对照，以双蒸水为空白对照；
B)用所述的试剂盒，进行PCR扩增，并以猪基因组DNA模板、狐水貂、鼠、鸡、鸭或马属DNA模板中的一种或多种为阳性对照，以双蒸水为空白对照；
3)对PCR扩增产物进行检测和结果判定。
优选地，其中步骤2)PCR扩增的反应体系如下：
表1本发明PCR扩增的反应体系
所述的PCR反应程序如下：
95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸15s，30
次循环；4℃降温2min；
结果判定方法是：当PCR反应产物与阳性对照扩增产物相符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中检测出猪源性成分；当PCR反应产物无扩增产物或与阳性对照扩增产物不符，且空白对照无扩增产物时，判定样品中未检测出猪源性成分；如果阳性样品未检测出预期片段，说明试剂失效或操作失误；若空白对照与阳性样品均检出，说明试剂污染或操作失误。
对于掺假的检查方法是以上述狐、水貂、鼠、鸡、鸭、马属引物对Ⅰ～Ⅵ扩增待检样品DNA，检测是否存在对应的扩增产物，并判断是否存在相应成分，判断方式同上。
本发明中检测结果可用琼脂糖凝胶电泳呈现，也可用测序或其他有效方法检测；提取样品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法，也可使用公认的、具有相同效力的其他提取方法。
本发明提供了有效的、精准的、可靠的猪源性成分鉴定或猪源性制品掺假检测的方法，所组装的试剂盒能快速鉴定样品中是否含有猪源性成分，以及是否掺有狐、水貂、鼠、鸡、鸭、马属等动物成分。本发明的方法可以在肉品、饲料和皮张检测中作为标准检测方法使用。本发明试剂盒及检测方法具有简便、快速、全面、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。附图说明
图1：是SEQIDNo.1所示的特异序列在猪中具有物种特异性的检测结果。以猪、牛(普通牛、水牛)、羊(绵羊、山羊)、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子的DNA为模板，扩增所述的特异片段，所有测试样品中仅在猪中得到扩增产物，非猪样品中均无扩增产物。结果表明所扩增片段在猪中具有特异性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；1-3：空白对照；4-6：猪；7-9：小鼠；10-12：大鼠；13-15：仓鼠；16-18：豚鼠；19-21：普通牛；22-24：水牛；25-27：绵羊；28-30：山羊；31-33：马；34-36：驴；37-39：鸡；40-42：鸭；43-45：鹅；46-48：兔；49-51：狐；52-54：狗；55-57：水貂；58-60：貉子。
图2：是SEQIDNo.1所示的特异序列在猪不同DNA模板浓度中的灵敏度检测结果。分别以0.1ng/μL、1ng/μL、10ng/μL、100ng/μL的猪DNA为模板，扩增所述的特异片段，1ng/μL的模板浓度即有扩增，表明特异性引物所扩增片段具有较好的灵敏性。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；1-4：空白对照；5-8：0.1ng/μL的模板浓度；9-12：1ng/μL的模板浓度；13-16：10ng/μL的模板浓度；17-20：100ng/μL的模板浓度。
图3：是SEQIDNo.1所示的特异性序列在猪不同品种的多个体中的保守性检测结果。以野猪、4个中国地方猪品种(通城猪、陆川猪、梅山猪、莱芜猪)和3个国外引进品种(大白猪、长白猪、杜洛克猪)的DNA为模板，扩增所述的特异片段，所有测试样品即所有猪的不同品种都得到特异性扩增，且一致性良好，表明所扩增片段在猪不同品种中具有保守性。泳道中编号说明如下：M：为DL2000plusDNAMarker；E：空白对照；N：多物种混合的阴性对照(无猪DNA)；1-3：野猪；4-6：通城猪；7-9：陆川猪；10-12：梅山猪；13-15：莱芜猪；16-18：长白猪；19-21：杜洛克猪；22-44：大白猪。
图4：是马属(马、驴)、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、鸡、鸭、狐和水貂的各特异性引物所扩增的特异序列在本物种中具有物种特异性的检测结果。采用上述引物对Ⅰ～Ⅵ，以猪、普通牛、水牛、羊(绵羊、山羊)、马、驴、鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)、豚鼠、鸡、鸭、鹅、兔、狗、狐、水貂和貉子的DNA为模板，扩增上述各物种的特异片段，所有引物仅在本物种中得到扩增产物，在非本物种样品中均无扩增产物。结果表明各物种引物以及所扩增片段具有物种特异性。如图：A：马属(马和驴)特异性引物扩增结果；B：鼠(大鼠、小鼠、仓鼠)特异性引物扩增结果；C：鸡特异性引物扩增结果；D：鸭特异性引物扩增结果；E：狐特异性引物扩增结果；F：水貂特异性引物扩增结果。
图5：是所组装的试剂盒对市场中猪肉制品掺假产品的检测结果。利用本专利中的试剂盒对市场中获取的13组猪肉熟食制品进行检测，发现有7组产品存在掺假问题。泳道中编号说明如下：M：为BM2000DNAMarker；E：空白对照；Z：猪阳性对照；J：鸡阳性对照；M：马阳性对照；1-4：猪肉产品中检出鸡源性成分掺假；5a、5b：同一猪肉产品中检出鸡源性和马源性成分掺假；6a、6b：同一猪肉产品中检出鸡源性和马源性成分掺假；7：猪肉产品中检出马源性成分掺假。