层析法的原理、分类以及应用介绍

层析法利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异（溶解度、分子极性、分子大小、分子形状、吸附能力、分子亲合力等），使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。

层析法进行时有两个相，一个相称为固定相，另一相称为流动相。由于各组分所受固定相的阻力和流动相的推力影响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得到分离。

层析技术与待分离混合物中各组分的理化性质（分子自然形状、大小、获电状态、溶解度与选择性吸附剂或载体物的吸附能力，分配系数、酸碱环境、温度、极性以及分子的亲和能力等）有着直接关系。除此，任何层析技术，均具有两相条件，造成流动相对固定相作单向相对运动。这种流动相推动样品中各组分通过固定相向前迁移，其运动速率与两相物质和被分离物质状态有关。由于被分离物各组分中的理化性质不同，对不同的两组或两组以上组分，具有不同的作用力，通过吸附一解吸，或离子交换、分子筛效应、静电引力，免疫特异性吸附等，造成各组间生物分子分离、迁移距离不等，最终达到被测物的分离、纯化的目的。这一技术的应用，不但能分离有机化合物，还能分离无机物，更主要的是适合于分离分析生物高分子物质，其分离范围广，适用性强。化学性稳定、灵敏度高，既可纯化又可制备，条件简便。

层析法分类如下：

1.凝胶层析

又称分子筛过滤或排阻层析等。固定相是多孔凝胶，各组分的分子大小不同，因而在凝胶上受阻滞的程度（移动速度）也不同。

优点：所用凝胶属于惰性载体，吸附力弱，操作条件温和，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果。

常用的凝胶有Sephadex G（葡聚糖凝胶）系列。凝胶层析可用于脱盐、分离提纯、测定高分子物质的分子量、高分子溶液的浓缩等。

2.离子交换层析

采用具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆交换的性质来分离离子型化合物的方法。主要用于分离氨基酸、多肽及蛋白质，也可用于分离核酸、核苷酸及其他带电荷的生物分子。

3.高效液相层析

在经典液相层析法基础上，引进气相层析的理论而发展起来的一项新颖快速的分离技术。具有分离能力强、测定灵敏度高、可在室温下进行、应用范围广等优点，对分离蛋白质、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等尤其有利。根据流动相和固定相相对极性，高效液相色谱分析可分为正相和反相两种。

4.亲和层析

利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离的目的。将可亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含混合组分的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质才能被固定相吸附结合，无关组分随流动相流出。亲和层析中所用的载体称为基质，与基质共价连接的化合物称配基。具有专一亲和力的生物分子对主要有：

抗原与抗体，DNA与互补DNA或RNA，酶与底物，激素与受体，维生素与特异结合蛋白，糖蛋白与植物凝集素等。亲和层析可用于纯化生物大分子、稀释液的浓缩、不稳定蛋白质的贮藏、分离核酸等。